Souhrn
- Fenotypová plasticita v rámci a napříč generacemi (transgenerační plasticita) umožňuje organismům a jejich potomkům přizpůsobit se prostředí bez modifikace podkladové DNA. Nedávné poznatky naznačují, že epigenetické modifikace jsou důležitými mediátory takové plasticity. Empirické studie se však doposud zaměřovaly hlavně na plasticitu v reakci na abiotické faktory, s ohledem na reakci na konkurenci.
- Testovali jsme mezigenerační a transgenerační fenotypovou plasticitu vyvolanou intenzitou konkurence mezi rostlinami a testovali jsme, zda byla zprostředkována metylací DNA, a to pomocí vytrvalé apomiktické byliny Taraxacum brevicorniculatum ve čtyřech koordinovaných experimentech. Poté jsme testovali důsledky transgenerační plasticity ovlivňující konkurenční interakce potomků a ekosystémových procesů, jako je například rozklad.
- Zjistili jsme, že podporou rozdílů v methylaci DNA se potomci rostlin pod silnější konkurencí vyvíjeli rychleji a představovali fenotypy konzervativnější z hlediska zdrojů. Dále tyto úpravy souvisejí s méně rozložitelnými listy, které mají potenciál snižovat obrat živin a mohou naopak upřednostňovat rostliny s konzervativnějšími znaky.
- Větší rodičovská konkurence zvýšila konkurenční schopnosti potomků spuštěním adaptivní fenotypové plasticity a snížila rozložitelnost listů potomků. Naše výsledky naznačují, že transgenerační účinky vyvolané konkurencí by mohly podpořit rychlé adaptace a koexistenci druhů a zpětnou vazbu na shromažďování biologické rozmanitosti a koloběh živin.
Úvod
Fenotypová plasticita, označovaná jako schopnost genotypu modulovat expresi svých znaků v reakci na životní prostředí (Price et al ., 2003 ; Turcotte & Levine, 2016 ), je považována za důležitý mechanismus, kterým se organismy mohou rychle adaptovat na měnící se ekologické podmínky (Rottstock et al ., 2017 ; Des Roches et al ., 2018 ; van Moorsel et al ., 2019 ). Tyto fenotypové úpravy by mohly mít velmi proměnlivou dobu trvání, fungovaly by během života jednotlivců (také se označuje jako mezigenerační plasticita), nebo by mohly být zděděny napříč generacemi (Turcotte & Levine, 2016). K pozdější transgenerační fenotypové plasticitě - zkrátka transgenerační plasticitě - dochází, když je fenotyp potomstva ovlivněn podmínkami prostředí, které rodiče zažívají (označováno také jako rodičovské nebo transgenerační účinky; Herman et al ., 2014 ; Turcotte & Levine, 2016 ). Velká většina stávajících studií o transgenerační plasticitě se zaměřuje na fenotypové odpovědi na abiotické faktory (Galloway a Etterson, 2007 ; Auge a kol ., 2017 ; Bej a Basak, 2017 ; Puy a kol ., 2020a ) a obecně přehlíželi roli biotické interakce (Alonso et al., 2019 ; Puy et al ., 2020b ), jako je soutěž mezi organismy. Tyto biotické interakce jsou však považovány za hlavní faktory pro řízení koexistence druhů, udržování biodiverzity a fungování ekosystému (Van der Putten et al ., 2013 ; Kraft et al ., 2015 ; Valladares et al ., 2015 ).
Fenotypová plasticita (v rámci generace a transgenerace) je poháněna různými „negenetickými“ mechanismy, které modifikují fenotyp, aniž by zahrnovaly změny v základní sekvenci DNA. Z těchto mechanismů byly jako nejpřímější mediátory navrženy epigenetické změny, jako je modifikace histonu, interference RNA nebo metylace DNA (Herman a Sultan, 2011 ; Herman a kol ., 2014 ). Je známo, že epigenetické modifikace způsobují variace vlastností (Zhang et al ., 2013 , 2018 ; Puy et al ., 2020a ) a vyskytují se v reakci na faktory prostředí (González et al ., 2016; Bej & Basak, 2017 ; Richards et al ., 2017 ; Puy et al ., 2020a ), někdy zprostředkující adaptivní reakci na stresory (Galloway & Etterson, 2007 ; Metz et al ., 2015 ; González et al ., 2016 ). A co je nejdůležitější, epigenetické modifikace jsou dědičné napříč generacemi (Akimoto et al ., 2007 ; Bossdorf et al ., 2008 ; Verhoeven et al ., 2010 ), což jsou klíčové mechanismy transgeneračních účinků (Herman et al .,2014 ; Richards et al ., 2017 ). Zejména methylace DNA - jeden z nejlépe pochopených epigenetických mechanismů v ekologii a evoluci (Akimoto et al ., 2007 ; Richards et al ., 2017 ) - je vynikajícím prostředníkem pro transgenerační dědičnost (Verhoeven et al ., 2010 ; Herman et. al ., 2014 ; Richards et al ., 2017 ), protože metylace cytosinů se dědí prostřednictvím mitózy a meiózy (Niederhuth & Schmitz, 2014 ).
Funkční vlastnosti určují schopnost organismů žít v daných ekologických podmínkách a koexistovat s jinými druhy (Götzenberger et al ., 2012 ; Kraft et al ., 2015 ). Organismy jsou však schopny funkčně přizpůsobit své vlastnosti tak, aby odpovídaly místním podmínkám, což může zase změnit sílu a výsledek ekologických interakcí (Kraft et al ., 2015 ; Turcotte & Levine, 2016 ). Například strategie využívání rostlinných zdrojů související s takzvaným „ekonomickým spektrem rostlin“ jsou spojeny se zásadním kompromisem mezi jednotlivci podél gradientu získávání zdrojů vs. zachování zdrojů (Reich, 2014 ; Díazet al ., 2016 ). Předpokládá se, že nejlépe rostou jednotlivci s charakteristickými rysy, jako je rychlejší nadzemní růst a „levnější“ a krátkodobé tkáně (tj. Vysoká specifická plocha listů, SLA; nízký obsah sušiny listů, LDMC; vysoká specifická délka kořene, SRL), zdroje jsou hojné. Na druhé straně jsou jedinci s konzervativními fenotypy charakterizovanými vyšší alokací kořenové biomasy a strukturálnějšími a tužšími tkáněmi (tj. Nízká SLA, vysoká LDMC, nízká SRL) obvykle lepší, když je nedostatek zdrojů (Reich, 2014 ; Díaz et al ., 2016 ; Puy a kol ., 2020b). Pokud existuje vhodná reakce na dobře přizpůsobené fenotypy, může fenotypová plasticita zvýšit druhovou zdatnost a podpořit adaptaci. Dále, pokud existuje transgenerační dědičnost reakce, fenotypová plasticita by mohla dokonce přispět k adaptaci následujících generací a podpořit rychlý adaptivní vývoj populace (Zhang et al ., 2013 ; van Moorsel et al ., 2019 ).
Kromě reakce na životní prostředí a biotických interakcí ovlivňují vlastnosti také prostředí, ve kterém žijí organismy, ovlivněním ekosystémových procesů, jako je koloběh živin (Cornelissen & Thompson, 1997 ; de Bello et al ., 2010 ). Tato myšlenka byla formována v oblasti funkční ekologie rámcem „reakce na účinek“ (Lavorel & Garnier, 2002 ), zdůrazňující dvojí roli vlastností jako adaptivních a hnacích prvků funkčnosti ekosystému. Rámec reakce na účinek by tedy mohl být teoreticky použit i v případě fenotypové plasticity, protože adaptace, které pomáhají organismům lépe se vyrovnat se svým prostředím, se mohou teoreticky vracet zpět k fungování ekosystému (Bossdorf et al.., 2008 ; Herman & Sultan, 2011 ; Richards et al ., 2017 ). Zůstává však nejasné, zda může plasticita (v rámci generací nebo napříč generacemi) přispívat zpět ke klíčovým funkcím ekosystému (Richards et al ., 2017 ; Puy et al ., 2020a ).
Zde jsme testovali existenci transgeneračních účinků vyvolaných konkurencí mezi rostlinami a zkoumali jsme jejich možnou zpětnou vazbu o adaptaci a fungování ekosystému. Za tímto účelem jsme provedli čtyři koordinované experimenty (pro jednu rodičovské generace, dvě potomstva generace, a jeden rozkladu experimentu, obr. 1 ) za použití geneticky identických jedinců Taraxacum brevicorniculatumKorol. Konkrétně jsme testovali, zda (1) konkurenceschopné interakce mezi rostlinami vyvolaly fenotypovou plasticitu směrem ke konzervativnějším strategiím, a to nejen v rámci generací, ale také napříč generacemi (transgenerační plasticita). Poté jsme analyzovali, zda (2) fenotypová plasticita byla zprostředkována epigenetickými mechanismy, výslovně methylací DNA. A nakonec (3) jsme prozkoumali, do jaké míry se transgenerační plasticita vrací zpět do konkurenčních interakcí, přispívá k adaptaci a ovlivňuje rozklad.
Materiály a metody
Studijní materiál
Taraxacum brevicorniculatum Korol. je obligátní apomiktický, polykarpický vytrvalý druh (Kirschner et al ., 2013 ), ekologicky podobný jakémukoli jinému Taraxacum (sekta Ruderalia ). Geneticky identická semena použitá v této studii byla shromážděna z populace rostlin pěstovaných ve skleníku, které vykazovaly stejné podmínky po několik generací (shromážděny a geneticky identifikovány Kirschner et al . ( 2013 )). Tato strategie zajistila homogenní genetickou a epigenetickou variabilitu rostlinného materiálu. Provedli jsme čtyři experimenty s použitím T. brevicorniculatum : rodičovská generace, dvě generace potomků a experiment rozkladu (obr. 1 ). Protože T. brevicorniculatum je obligátní apomiktický druh, všechny rostliny ve všech experimentech byly geneticky identické; a poté, co během rodičovských generací zažili různé úrovně konkurence, se potomci lišili pouze v negenetických informacích, které zdědili. Jakékoli rozdíly v generaci potomků tedy byly způsobeny transgeneračními účinky vyvolanými konkurencí v rodičovské generaci, které nezahrnovaly změny v sekvenci DNA (tj. Negenetické nebo epigenetické účinky).
Experimentální nastavení
Rodičovská generace.
K vyvolání transgeneračních účinků souvisejících s konkurencí jsme provedli dvouměsíční experiment ve skleníku (polovina května - polovina července 2015), kde byly geneticky identické jedince T. brevicorniculatum pěstovány s konkurencí nebo bez ní až do kvetení. U nádob s konkurencí jsme zasadili jednoho jedince z ohniskových druhů obklopeného šesti dalšími jedinci. Šest okolních jedinců mohlo být buď monospecifických (tj. Pouze jeden druh buď ze samotného T. brevicorniculatum nebo 10 dalších různých druhů, replikovaných osmkrát na kombinaci; viz tabulka podpůrných informací S1 ) nebo směs šesti různých druhů (osm různých kombinací, replikováno pětkrát; viz tabulka S1). Výsledkem bylo 19 úrovní soutěže. Dále bylo provedeno bezkonkurenční ošetření (replikováno osmkrát), kde byl do květináče zasazen pouze fokální jedinec T. brevicorniculatum ; to dalo celkem 20 různých úrovní soutěže. Všechny kombinace byly vysazeny po odděleném vyklíčení semen v Petriho miskách a následném přesazení semenáčků do kulatých nádob s objemem 2 l naplněných směsí písku a komerční půdy v poměru 1: 1. Během celého experimentu byly rostliny pravidelně zalévány ze dna, aby byl povrch nádoby vlhký.
Odhadli jsme intenzitu konkurence, kterou zažívá fokální T. brevicorniculatum, s indexem relativní intenzity interakce (RII), který odráží účinek konkurence porovnáním nadzemní biomasy pozorované při růstu s konkurencí s dosaženou biomasou při absenci interakce podle vzorce popsaného v Armas et al . ( 2004). Čím negativnější je hodnota RII, tím silnější je snížení biomasy, které ohnisková rostlina zaznamenala, v porovnání s biomasou bez konkurence. V důsledku toho jsme v následujících experimentech použili průměrný RII ve všech nádobách z každé z 20 kompetičních ošetření rodičovského experimentu k vyjádření intenzit kompetice, které zažívá rodičovská generace, jako spojité proměnné (viz tabulka S1 ).
Na konci experimentu rodičovské generace byla odebrána semena každé fokální rostliny. Po měření průměrné hmotnosti semen na úrovni kompetice byla semena skladována v chladu (2–4 ° C).
Pokus 1: Demetylace u juvenilních potomků
Cílem tohoto experimentu bylo otestovat transgenerační účinky na výkon juvenilních potomků a otestovat, zda byly tyto účinky přenášeny pomocí methylace DNA. Za tímto účelem jsme použili semena pocházející od jednotlivců, kteří během předchozího soutěžního experimentu zažili monospecifickou konkurenci. Sazenice z těchto semen byly pěstovány jednotlivě a bez konkurence v růstové komoře, dokud nedosáhly stádia mladistvých. Rostliny byly pěstovány s 12 h: 12 h světlo: tma a 20 ° C: 10 ° C teplotním režimem a pravidelně zalévány. Z každé monospecifické úrovně rodičovské kompetence jsme vytvořili 20 nádob (7 cm × 7 cm, hloubku 18 cm) a u poloviny z nich jsme změnili epigenetický stav demetylací DNA pomocí 5-azacytidinu. Experimentální demetylace je dobře zavedená metoda, při které se odstraňují epigenetické stopy (dědičné nebo nikoli); to nám umožňuje otestovat, zda fenotypové vlastnosti byly či nebyly zprostředkovány epigenetickými mechanismy (Richardset al ., 2017 ; Puy et al ., 2018 ; Alonso et al ., 2019 ).
Pro měření klíčení bylo do každého květináče umístěno šest semen a po 11 dnech, kdy všechny květináče obsahovaly alespoň jednoho jedince se skutečným listem (tj. Bez děložních lístků), se vynořené sazenice ztenčily, dokud v každém květináči nezůstalo jen to největší . Současně (po 11 dnech) jsme začali aplikovat demetylační ošetření, které zahrnovalo postřik 50 μM vodného roztoku 5 ‐ azacytidinu na listy denně po dobu 6 týdnů - podle Puy et al . ( 2018). Abychom z našeho návrhu odstranili jakýkoli potenciální účinek nerovnoměrných podmínek růstu, distribuovali jsme replikáty do 10 bloků, každý z nich včetně dvou replikátů každé z 11 monospecifických úrovní kompetice, jeden s a bez demetylační úpravy. Konečný návrh tedy zahrnoval 10 bloků, 11 úrovní konkurence a 2 demetylační ošetření, což dalo celkem 220 rostlin. Pozice replikátů pro každou úroveň kompetice byla randomizována mezi bloky, ale udržována mezi demetylačními ošetřeními v blocích. Jako substrát pro zalévání byl ve všech případech používán písek, aby se usnadnila extrakce kořenů během sklizně.
Experiment s potomky 2: Soutěžní experiment s dospělými potomky
Cílem tohoto experimentu bylo otestovat transgenerační účinky na potomky v dospělosti. V tomto případě potomci podstupují konkurenční intenzitu podobnou nebo odlišnou od svých rodičů. Transgenerační účinky považujeme za adaptivní, když potomci žijící za stejných podmínek jako jejich rodiče mají v těchto podmínkách lepší výkon (např. Vyšší biomasa) než rostliny jiného původu. V tomto experimentu byla vybrána semena ze šesti z 20 úrovní rodičovské konkurence, aby se dosáhlo zvládnutelné experimentální velikosti. Šest úrovní zahrnovalo následující: dvě intenzivní úrovně konkurence (jedna z monospecifické a další z kombinace směsi), dvě slabé úrovně konkurence (jedna z monospecifické a další z kombinace směsí), vnitrodruhová konkurence a žádná konkurence (viz tabulka S1 ). Abychom tak učinili, po vyklíčení semen v Petriho miskách jsme transplantovali a vypěstovali potomky pod šesti konkurenčními úrovněmi, které zažila rodičovská generace, pomocí úplného faktoriálního designu. Tento návrh zohledňoval všech šest úrovní konkurence (šest úrovní konkurence rodičů a šest úrovní konkurence potomků, což dává 36 kombinací). Po stejném experimentálním nastavení jako v rodičovské generaci jsme provedli dvouměsíční experiment ve skleníku (polovina května - polovina července 2016), kde bylo do skleníku náhodně umístěno 12 replikátů na kombinaci podmínek rodič - potomek celkem 432 hrnců. Hrnce, substrát a režim zavlažování byly stejné jako v rodičovském experimentu, aby byly zajištěny co nejpodobnější podmínky.
Experiment rozkladu
Zaměřili jsme se na testování, zda účinky transgenerační plasticity prodlužují život jedinců potomků, což ovlivňuje rozložitelnost jejich listů a stárnoucího materiálu. Za tímto účelem jsme inkubovali pět replikátů na ošetření čerstvých listů z experimentu s potomky 2 a jako referenci jeden replikát stárnoucího materiálu. Rostlinný materiál byl odebrán během sklizně experimentu s potomky 2 a vysušen v sušárně při 60 ° C. Vzorky byly inkubovány v nylonových pytlích o rozměrech 18 cm × 18 cm se sítem o velikosti 1 mm na dně a sítem o velikosti 4 mm nahoře, aby se zabránilo ztrátě materiálu podestýlky a současně se umožnil přístup makrofauny k podestýlce. Každý vak obsahoval 0,36 g biomasy. Tašky byly umístěny do účelového venkovního inkubačního lůžka, které se nachází v otevřeném prostoru botanické zahrady Botanického ústavu v Třeboni, Česká republika (49 ° 00'20 ″ severní šířky, 14 ° 46'25 ″ východní délky). Pro zachování homogenních podmínek mikroprostředí bylo inkubační lože očištěno od vegetace a pokryto pískem. Ze stejného důvodu byly vaky pokryty 1 cm písku. Extra vzorky všech ošetření byly inkubovány a kontrolovány každé 2 týdny, aby bylo možné sledovat rychlost rozkladu a ukončit experiment, když vzorky dosáhly v průměru minimálně 50% ztráty biomasy (Pérez ‐ Harguindeguyet al ., 2013 ). Inkubace začala 19. září a byla ukončena 21. října, kdy vzorky ztratily c . 65% biomasy.
Měřené proměnné
Rodičovská generace
V době sklizně jsme měřili produkci semen (tj. Počet semen), celkovou suchou biomasu (radikální a vzdušnou) na rostlinu a nadzemní vegetativní znaky (Pérez ‐ Harguindeguy et al ., 2013 ). Pro každou fokální rostlinu byly shromážděny dva listy, které byly skenovány a poté zváženy, nejprve čerstvou hmotou a druhou suchou hmotou po sušení při 60 ° C (48 hodin). Tato měření jsme použili k odhadu SLA (plocha listu na jednotku suché hmotnosti, mm 2 mg −1 ) a LDMC (poměr suché hmoty listu k čerstvé hmotnosti listu, mg mg −1). Jak již bylo zmíněno, intenzita konkurence ohniskového jedince byla odhadnuta pomocí indexu RII na základě nadzemní biomasy. Použití jiných indikátorů k měření RII (např. Celková biomasa nebo produkce osiva) přineslo podobné výsledky, protože jsou vysoce korelované (Pearsonovy koeficienty 0,97, respektive 0,79). Transformovali jsme 20 úrovní konkurence do spojité proměnné odrážející gradient konkurence tak, že jsme každé úrovni přiřadili průměrné RII ohniskových rostlin na příslušné konkurenční úrovni (viz tabulka S1 ). To nám umožnilo charakterizovat každou rostlinu v experimentech s potomky pomocí „rodičovské soutěže“ RII.
Pokus 1: Demetylace u juvenilních potomků
Počet vyklíčených semen na květináči byl počítán pětkrát (4, 6, 8, 10 a 11 dní po zasetí, vždy před aplikací demetylační úpravy). Celkové procento klíčení bylo vypočteno jako konečné kumulativní klíčení šesti zasetých semen. Také vypočteno T 50 (tj čas, ve kterém polovina z celkového klíčivost byla dosažena v každé nádoby, po Coolbear et al . ( 1984)). Každý čtvrtý den, počínaje 4 d po zahájení demetylační léčby až do konce experimentu (6 týdnů), jsme měřili maximální průměr růžice (centimetry) a celkový počet listů. Tuto informaci jsme použili k odhadu rychlostí růstu rostlin; za tímto účelem jsme v každé nádobě regresovali průměr růžice a počet listů proti času (ve dnech) pomocí lineárních a Poissonových regresí. Použili jsme svahy těchto regresí v každém banku jako indikátory rychlosti růstu v těchto dvou parametrech, přičemž větší svahy označují rychlejší růst.
Epigenetické rodičovské účinky pravděpodobně časem odezní (Dechaine et al ., 2015 ). Zkontrolovali jsme to odhadem výše popsaných rychlostí růstu několikrát v každém banku; první rychlosti růstu byly odhadnuty s ohledem pouze na první čtyři měření (tj. 4, 8, 12 a 16 dní po zahájení demetylační léčby) a poté jsme odhadli rychlost růstu pro každý den, kdy bylo provedeno nové měření (každé včetně měření do té doby). Tak, celkem, protože jsme měří každé 4 d, z prvního 16 d až do 42 nd den jsme měli sedm měření rychlosti růstu.
Na konci experimentu byly rostliny sklizeny, nadzemní a podzemní vegetativní znaky a byla měřena celková biomasa (Pérez ‐ Harguindeguy et al ., 2013 ). Pro každou rostlinu byly měřeny SLA a LDMC. Kromě toho byly kořeny opatrně extrahovány vykořením celého kořenového systému, promytím, skenováním a zvážením jako čerstvé hmoty a poté suché hmoty po sušení při 60 ° C (48 hodin). Celková délka kořene, průměrný průměr kořene (milimetry) a distribuce délky kořene v různých třídách průměru byly stanoveny pomocí softwaru pro analýzu obrazu WinRhizo Pro , 2008 (Regent Instruments Inc., Quebec, Kanada). Tato měření jsme použili k odhadu SRL (délka kořene na jednotku suché hmotnosti, m g -1), obsah kořenové sušiny (RDMC; poměr suché hmotnosti kořene k čerstvé hmotnosti kořene, mg mg −1 ) a procento jemných kořenů (poměr délky kořene s průměrem <0,5 mm děleno celkovou délkou kořene). Dále jsme odhadli hmotnostní faktor kořene (RMF; poměr kořenové biomasy k celkové biomase, g g −1 ) po vysušení zbývajících nadzemních částí rostlin při 60 ° C (48 h).
Experiment s potomky 2: Soutěžní experiment s dospělými potomky
Celková rostlinná biomasa a reprodukční investice (tj. Počet semen na jednotku rostlinné biomasy) byly měřeny v době sklizně, stejně jako u rodičovské generace. Kromě toho jsme pro každou rostlinu měřili SLA, LDMC, SRL, procento jemných kořenů a RMF podle protokolů popsaných dříve (Pérez ‐ Harguindeguy et al ., 2013). Kromě toho jsme u pěti replikátů na rodičovský a potomský stav měřili obsah uhlíku (C), dusíku (N) a fosforu (P) v listech a také obsah skladování sacharidů v kořenech. Celkové koncentrace C a N byly stanoveny suchým spalováním za použití elementárního analyzátoru (CHNS Elemental Analyzer vario MICRO cube; Elementar Analysensysteme GmbH, Langenselbold, Německo). Celkové P bylo stanoveno průtokovou injekční analýzou a obsah skladovaných sacharidů byl měřen pomocí postupu stanovení celkového škrobu (Megazyme, Bray, Irsko) podle metody amyloglukosidáza / alfa-amyláza.
Experiment rozkladu
Ztráta biomasy byla vypočtena jako rozdíl mezi počáteční a zbývající biomasou. Vzhledem k tomu, že vzorky bylo obtížné oddělit od písku, byla změřena zbývající biomasa po spálení vzorků ve speciálně navržené peci při teplotě 575 ° C po dobu 4 hodin. Zbývající biomasa po rozkladu byla tedy vypočtena jako rozdíl mezi počáteční hmotností před spálením a konečnou hmotností po odstranění popela, přičemž zbyl pouze anorganický materiál.
Statistická analýza
Všechny analýzy byly provedeny pomocí R v.3.2.3 (R Core Team, 2016 ) s α = 0,05 jako prahem významnosti. Protože rodičovská konkurence může generovat rozdíly v zajišťování semen potomstva, které by mohly maskovat další transgenerační účinky na jeho výkon a fenotyp (Herman & Sultan, 2011 ; Dechaine et al ., 2015 ; Germain et al ., 2019 ), zahrnuli jsme semenovou hmotu jako kovariát ve všech analýzách, když byl jeho účinek téměř významný ( P <0,10).
Pokus 1: Demetylace u juvenilních potomků
Testovali jsme účinek rodičovské soutěže (RII vypočítané z rodičovského experimentu) na klíčení potomků ( T 50 a procento klíčení) a rychlost růstu (rychlost růstu průměru růžice a rychlost produkce listů, obě měřeny každé 4 dny od prvních 16 dnů do element 42 nd den). Zkoumali jsme také vliv rodičovské soutěže na funkční vlastnosti potomků, přičemž jsme zvážili jednotlivé vlastnosti a všechny vlastnosti dohromady. Ke druhému bylo přistoupeno pomocí analýzy hlavních komponent (PCA) kombinující různé vlastnosti, provedené za účelem zmenšení prostoru s více vlastnostmi na jednu hlavní osu, jak uvádí Kraft et al . ( 2014). Kromě toho, abychom otestovali, zda rodičovské účinky na parametry potomstva závisí na epigenetických modifikacích, jsme zkontrolovali účinek demetylační léčby (demetylovaná vs. kontrola) a její interakce s rodičovskou konkurencí. Toto poslední srovnání nebylo provedeno pro indexy související s klíčením, protože v této fázi nebylo použito demetylační ošetření. Vybavili jsme model smíšených efektů, kde rodičovská konkurence, demetylační léčba a interakce byly použity jako fixní faktory a hmotnost semen byla zahrnuta jako kovariantní. Experimentální bloky byly použity jako náhodný faktor. Protože u některých parametrů byl termín interakce téměř významný (tj. Pod P = 0,10), což naznačuje, že existuje určitý odlišný účinek kompetice v závislosti na demethylaci, také jsme se rozhodli rozdělit data mezi demetylované a nedemetylované jedince, abychom samostatně zkoumali potenciální odlišný účinek rodičovské konkurence v rámci demetylační léčby.
Potomek 2 a experiment rozkladu
Hodnoty kompetice rodičů a potomků byly přiřazeny na základě hodnoty RII naměřené v experimentu rodičovské soutěže (viz dříve; tj. Průměr hodnot RII na úrovni léčby). Jinými slovy, každé z úrovní konkurence (bez ohledu na to, zda pocházejí z rodičovské nebo potomkovské generace) jsme přiřadili hodnotu síly konkurence na základě RII měřené v rodičovské generaci. Například rostlina potomstva pocházející z rodičovské rostliny, která v rodičovském experimentu soutěžila s Leontodonem, by měla hodnotu rodičovské soutěže rovnou -0,59 (tabulka S1 ). Pokud tato potomská rostlina roste se stejným konkurentem v experimentu s potomky 2, bude (očekávaná) hodnota konkurence potomků stejná (RII = −0,59; tabulka S1), protože RII byla měřena v rodičovském experimentu. Pokud však dotyčná potomská rostlina roste s jiným konkurentem v experimentu s potomky 2 (např. Soutěžící s Plantago media ), bude (očekávanou) hodnotou konkurence potomků hodnota RII odpovídající úrovně konkurence měřená v rodičovském experimentu (např. P média RII = -0,24; tabulka S1 ).
Vliv konkurence rodičů a potomků na vlastnosti rostlin (jednotlivé vlastnosti a také kombinace PCA) byl analyzován pomocí modelů smíšených účinků s konkurencí rodičů a potomků a jejich interakcí (pokud je blízká významné; P <0,10) jako fixních faktorů a do úvahy hmotnost semen jako kovariabilní. Poloha jednotlivce ve skleníku byla použita jako náhodný faktor pro zohlednění potenciálních účinků prostorové heterogenity. Podobně byl analyzován vliv rodičovské a potomkovské konkurence na rozklad listů a vrhů pomocí lineárních regresních modelů se stejnými pevnými faktory a kovariátami jako smíšené modely, ale bez náhodného faktoru (protože v experimentu s rozkladem nebyly žádné bloky).
Výsledek
Rodičovská generace
Analýza experimentu rodičovské generace ukázala, že všech 20 různých úrovní kompetice použitých v experimentu bylo škodlivých pro biomasu T. brevicorniculatum (tj. Negativní RII; tabulka S1 ). Dále jsme v rámci generace sledovali fenotypovou plasticitu směrem ke konzervativnějšímu fenotypu (tj. Vyšší LDMC a RMF), který lineárně souvisel s konkurenční silou (obr. S1 ).
Pokus 1: Demetylace u juvenilních potomků
Zjistili jsme, že mladiství potomci pocházející z rodičů, kteří zažili intenzivnější konkurenci, měli rychlejší klíčení (tj. Nižší T 50 ; F = 6,76, df = 208, P = 0,010; obr. 2a ; tabulka S2 a), ale bez rozdílů v celkovém procentu klíčení ( z = -0,008, P = 0,994; tabulka S2 a) a rychlejší růst (měřeno jako rychlost vytváření listů; F = 8,35, df = 206, P = 0,004; tabulka S2 a).
Konkurence, kterou rodiče zažívali, ovlivnila také fenotypové vlastnosti potomstva, a to se u demetylovaných a nedemetylovaných populací dost odlišně (konkurence: demetylační interakce; F = 2,83, df = 206, P = 0,09; tabulka S2 a), což znamenalo účinek konkurence v rámci každého demetylačního ošetření vyžadoval posouzení. V PCA na základě souboru měřených znaků první osa absorbovala 46% variace a odrážela gradientní strategii využívání zdrojů mezi jednotlivci: od pozitivnějších hodnot PCA odrážejících rostliny s konzervativní strategií (vyšší LDMC, RMF a root průměr) k negativnějším hodnotám u jedinců s více přijatelnou strategií (vyšší SLA, SRL a procento jemných kořenů; obr. S2 ). Při použití skóre PCA jsme pozorovali, že potomci získali konzervativnější fenotyp se silnější rodičovskou konkurencí, zejména když byli nedemetylovaní ( F = 4,05, df = 98,02, P = 0,047; obr. 2c ; tabulka S2 b). Když jsme však odstranili epigenetický podpis jednotlivců pomocí demetylačního činidla (Puy et al ., 2018 ), účinek rodičovské konkurence zmizel (fenotyp: F = 0,19, df = 96,90, P = 0,663; obr. 2c ; Tabulka S2 b), což naznačuje, že byla řízena epigeneticky pomocí methylace DNA.
Na druhé straně demetylační ošetření nezměnilo růst rostlin (tj. Ani přímo, ani interakcí s rodičovskou konkurencí; tabulka S2 a). Při hodnocení efektu kompetice v rámci každé demetylační léčby jsme však zjistili, že potomci rodičů, kteří zažívají intenzivnější kompetici, rostly rychleji, pouze když byli nedemetylovaní ( F = 7,42, df = 98,09, P = 0,008; obr. 2b ; tabulka S2 b). Když byli potomci demetylovaní, nenašli jsme tuto odpověď ( F = 1,90, df = 98,08, P = 0,172; obr. 2b ; tabulka S2b). Tento výsledek také naznačuje, že rodičovská soutěž pravděpodobně vyvolala rozdíly ve vzorcích methylace DNA.
Experiment s potomky 2: Soutěžní experiment s dospělými potomky
Funkční rysy potomků byly silně ovlivněny konkurenčním prostředím potomků a směrem k fenotypům konzervativnějším z hlediska zdrojů v reakci na silnější konkurenci (obr. 3 ; tabulka S3 ). Navíc pro některé z vlastností (SLA, RMF, ukládání sacharidů přidělení, hmoty semen, a produkce semen na jednotku biomasy, obr. 3 : Tabulka S3 ), jsme zjistili, že transgenerational účinky dále posílena konzervativní fenotyp, když je potomstvo pochází z rodiče, kteří zažili silnou konkurenci. Tyto transgenerační účinky byly buď v souladu s plastickou odpovědí na konkurenční prostředí potomků (např. Nižší SLA, vysoký RMF; obr. 3a, b ; tabulka S3) nebo provozován bez ohledu na podmínky potomstva (např. přidělení více zásobních sacharidů; obr. 3d ; tabulka S3 ). Potomci od rodičů, kteří neutrpěli žádnou nebo jen malou konkurenci, se zmenšovali, když rostli se silnou konkurencí, zatímco potomci od rodičů se silnou konkurencí vykazovali opačný vzorec a stávali se vyššími, když měli konkurenční prostředí (obr. 3c, f ; tabulka S3 ).
Experiment rozkladu
Ukázali jsme, že zvyšující se hladiny obou potomků ( F = 24,03, P <0,001) a rodičovské konkurence ( F = 8,32, P = 0,004) vedly ke snížení rychlosti rozkladu listů (obr. 4 ; tabulka S4 ), což odpovídá posunu ve více konzervativní rysy ukázané dříve zde. Účinek rodičovské konkurence na rozklad byl zprostředkován změnami vlastností listů, které tyto procesy regulují; rychlosti rozkladu byly pozitivně korelovány s obsahem SLA a listu P a negativně s poměrem obsahu LDMC a listu C: N (obr. S3 ). Podestýlka se rozkládala podle stejného rozkladového vzoru jako čerstvé listy (obr. S4 ; tabulka S4).
Diskuse
Pokud je nám známo, tato studie poskytuje první empirické důkazy o důležitosti rodičovské soutěže ovlivňující konkurenci a fungování následujících generací prostřednictvím transgenerační plasticity. Zjistili jsme, že silnější konkurence vyvolala během generace fenotypové modifikace směrem ke konkurenceschopnějšímu fenotypu konzervativnímu z hlediska zdrojů. Zjistili jsme, že potomci rostlin pod silnější konkurencí měli také fenotypy konzervativnější z hlediska zdrojů a rychlejší vývoj, i když nebyli ve vysoce konkurenčním prostředí. Dále jsme prokázali, že tyto transgenerační účinky jsou s největší pravděpodobností řízeny mechanismy methylace DNA. Prostřednictvím experimentu s rozkladem listů jsme zjistili, že silnější rodičovská konkurence má za následek méně rozložitelné listy,
Několik studií prokázalo význam zvláštnosti plasticity pro shromažďování a fungování populací a komunit (Price et al ., 2003 ; Rottstock et al ., 2017 ; Des Roches et al ., 2018 ; Puy et al ., 2020a ). Ačkoli lze u rostlin očekávat rychlejší růst levnějších tkání (tj. Náchylných k rychlému úbytku tkání), aby se vyvažovala konkurence o světlo, často byly nalezeny vnitrodruhové úpravy směrem ke konzervativnějším fenotypům v reakci na kompetitivní interakce rostlin a rostlin (Kraft et al ., 2015 ; Carmona et al .,2019 ). V našem případě jsme během rodičovské generace našli stejný vzorec mezigenerační plasticity, kde silnější konkurence spustila úpravy vlastností směrem ke konzervativnějšímu fenotypu (tj. Vyšší LDMC a RMF; obr. S1 ). Tato úprava může zvýšit schopnost rostliny vyrovnat se se stresem a může vést k adaptaci, když v konkurenční hierarchii dominují konzervativnější strategické fenotypy (jako v Kraft et al ., 2015 ), které podporují koexistenci snížením hierarchií vlastností a konkurence intenzita (Carmona et al ., 2019). Poté jsme předpokládali, že pokud by tyto fenotypové změny byly přeneseny na potomky prostřednictvím transgeneračních účinků, mohlo by to zase změnit konkurenční interakce v příští generaci. Toto je první práce, která uvádí, že konkurenční interakce spouští transgenerační plasticitu, která ovlivňuje nejen časnou výkonnost potomků, ale také jejich stádium dospělosti a ekosystémové procesy.
Zjistili jsme, že mladiství potomci pocházející z rodičů, kteří zažívají intenzivnější konkurenci, dosáhli vyšší konkurenční výkonnosti a výhod prostřednictvím výhod, včetně rychlejšího klíčení a rychlejšího růstu (Afonso et al ., 2014 ; Larson et al ., 2020 ). Dále potomci rodičů pod silnou konkurencí vykazovali konzervativnější fenotyp využívání zdrojů (tj. Vyšší LDMC, RMF a průměr kořene) při zachování stejného vzorce jako rodičovská generace (obr. S1). Konkurence rodičů může ovlivnit výkonnost a fenotyp potomstva prostřednictvím dvou hlavních mechanismů: vytvářením rozdílů v zajišťování semen nebo v kvalitě zásobené mateřskými rostlinami v embryích nebo pomocí mechanismů epigenetických variací (Herman & Sultan, 2011 ; Dechaine et al ., 2015 ; Metz et al ., 2015 ; Germain et al ., 2019). V naší studii silnější rodičovská konkurence produkovala menší semena. Účinky rodičovské konkurence však zůstaly významné i po zahrnutí semenné hmoty jako kovariátu. To naznačuje, že modifikace embryí nebyly jediným mechanismem, který řídil naše pozorované transgenerační účinky, a ukazuje na další mechanismy, jako jsou dědičné epigenetické modifikace nebo hormonální rovnováha v embryích (Herman & Sultan, 2011 ; Rottstock et al ., 2017 ). I když je pravděpodobné, že jakékoli rodičovské účinky časem odezní (Dechaine et al ., 2015 ; Puy et al ., 2020b ), zdá se , že účinky spojené s rozdíly v hromadě semen rychle vymizí (Latzelet al ., 2010 ). Mezitím, vliv hmoty semen na rychlosti růstu trvalo až do 24 -tého dne (tj 35-d-staré rostliny) a transgenerational účinky přetrvávala až do konce experimentu (viz obr. S5 ). V našem případě rozdíly ve výkonu a fenotypu jednotlivců zmizely, když jsme použili demetylační činidlo, které odstranilo epigenetický podpis rostlin (Puy et al ., 2018 , 2020a). To silně naznačuje, že pozorované adaptivní transgenerační účinky byly kontrolovány epigeneticky a alespoň částečně umožněny methylací DNA. Bylo by však zapotřebí podrobné molekulární studie rostlinného materiálu, aby se zcela potvrdila důležitost role methylace DNA jako hnacího mechanismu pozorovaných transgeneračních účinků, a budoucí experimenty by to měly zohlednit.
Zjistili jsme, že transgenerační účinky přetrvávaly i v dospělosti. V této fázi transgenerační účinky dále posílily konzervativní fenotyp, když potomci pocházeli od rodičů, kteří zažívali silnou konkurenci (obr. 3a, b ). Transgenerační plasticitu považujeme za adaptivní, protože i když jsme nezaznamenali lepší výkonnost potomků, kteří znovu zažili přesný stav jako jejich rodiče, pokud jde o biomasu (obr. 3f ), potomci vzrostli, když byli ve stejném konkurenčním prostředí jako jejich rodiče (obr. 3c). Dohromady tyto výsledky potvrzují širokou fenotypovou modifikaci v důsledku podmínek rodičovského soužití, které jsou udržovány v generaci potomků. Ačkoli transgenerační plasticita zdaleka nebyla zanedbatelná, zdálo se, že je méně silná než mezigenerační plasticita. Ačkoliv tedy transgenerační plasticita funguje jako adaptivní „stresová paměť“, která zlepšuje schopnost potomků vyrovnat se s předpovězeným prostředím, mezigenerační plasticita by ji mohla přepsat a umožnit potomkům přesněji reagovat na jejich vlastní podněty k prostředí (Auge et al. ., 2017). Zároveň je třeba poznamenat, že shodné reakce v rámci a napříč generacemi by mohly působit synergicky, což by vedlo fenotypy potomků ke vzdálenému optimu; a dokud bude selektivní prostředí přetrvávat (tj. prostředí, které prožívají potomci, bude odpovídat prostředí rodičů), mohlo by to urychlit adaptaci na prostředí (Herman et al ., 2014 ; Auge et al ., 2017 ). Tímto způsobem jsou pravděpodobně biotické interakce rostlina - rostlina předvídatelné (tj. Rodičovské prostředí je dobrým prediktorem prostředí potomků v prostoru nebo čase); proto je posílena adaptivní hodnota plasticity v reakci na tyto interakce (Burgess & Marshall, 2014 ; Herman et al.., 2014 ; Metz a kol ., 2015 ).
Nakonec jsme našli důkazy, že transgenerační efekty nejsou vyvolány pouze, ale také utvářejí prostředí ovlivňováním ekosystémových procesů, jak se očekávalo z rámce reakce na účinek (Lavorel & Garnier, 2002 ). Konkrétně jsme ukázali jasný příklad, kdy se transgenerační účinky mohou rozšířit ve větším měřítku a ovlivnit „afterlives“ jednotlivců ovlivněním rozkladu listů. Zvyšující se úrovně potomků a rodičovská konkurence vedly ke konzervativnějším vlastnostem listů (jako je LDMC a list C: N), které souvisejí se strukturálnější a pomaleji degradující organickou hmotou v listech, jejichž návrat do půdy trvá déle (Cornelissen & Thompson , 1997). Je zajímavé, že pomalejší degradace může zase upřednostňovat ty rostliny s fenotypem, který je konzervativnější z hlediska využívání zdrojů a které mají nižší míru absorpce živin, což následně ovlivňuje konkurenční interakce rostlin a rostlin (Van der Putten et al ., 2013 ; Semchenko et al ., 2017 ). Tím se otevírá nová oblast výzkumu potenciální pozitivní zpětné vazby mezi rostlinami a půdou vyvolané konkurencí mezi rostlinami.
V kontextu, kde je stále více uznáván význam vnitrodruhové variability pro populace a komunity, poskytuje naše studie přesvědčivé důkazy o tom, jak dědičné epigenetické fenotypové úpravy mohou mít relevantní a rozmanité ekologické důsledky jak pro soužití, tak pro fungování ekosystému. Naše studie například přidává transgenerační plasticitu jako důsledek a hnací motor koexistence mezi druhy (Kraft et al ., 2015 ; Turcotte & Levine, 2016 ; Carmona et al ., 2019 ) a navrhuje možné důsledky transgenerační plasticity na rychlou adaptaci a koloběh živin (Van der Putten et al ., 2013 ; Semchenkoet al ., 2017). Samozřejmě, protože naše studie je pouze prvním důkazem koncepce relevance rámce reakce na účinek v kontextu transgenerační plasticity, je jistě nutné další zkoumání. V tomto smyslu bude možná nutné rozšířit ekologickou relevanci a realismus naší studie, protože jsme v experimentálně kontrolovaných prostředích použili pouze jeden genotyp rostliny. K pochopení významu transgenerační plasticity v reakci na různé biotické interakce jsou zapotřebí realističtější studie. Takové studie by mohly zahrnovat například zkoumání toho, do jaké míry jsou zachovány dědičné úpravy napříč generacemi, nebo zkoumání, zda jsou tyto úpravy nalezeny experimentálně i v terénu u mnoha různých druhů v přirozených populacích.